Wie werden Zellen eigentlich an einem hämatologischen Analysengerät differenziert und gezählt?
Heutzutage lässt sich dies nicht mehr so einfach beantworten, denn seit den Anfängen der automatisierten Zählung in den 50er Jahren hat sich die Technologie stetig weiterentwickelt.

Impedanzmessung

Gerade in den letzten 10 - 20 Jahren haben sich vielfältige Methoden etabliert. Das erste automatisierte Messprinzip für die Zellzählung war das Widerstandsmessprinzip. Es konnte sowohl zur Zählung von Leukozyten als auch Erythrozyten und Thrombozyten eingesetzt werden. Diese Methode ist auch heute noch in einigen Systemen eine zentrale Methode zur Quantifizierung der Zellpopulationen, vor allem in den sogenannten 3-part –Diff-Systemen (z.B. Sysmex pocH-100i und XP-300), oder als Standard-Methode für die RBC- und PLT-Zählung in Sysmex 5-part-Diff-Systemen.
Die Technologie der Impedanzmessung wurde im Laufe der Jahre technisch immer weiter verfeinert. Die Verwendung der hydrodynamischen Fokussierung (Ummantelung des Zellstroms während der Impulsmessung) zum Beispiel ermöglichte eine enorme Verbesserung der Genauigkeit. Die Partikel passieren die Messöffnung zentral und Störsignale können weitestgehend ausgeschlossen werden.

5-part-Differenzierung

In der 5-part-Differenzierung hat sich in der Hämatologie eine Vielzahl unterschiedlicher Technologien etabliert. Eine der frühesten Methoden, um gleichzeitig mehrere Informationen über eine Zelle zu erhalten, ist die optische Streulichtmessung. Zumeist werden Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht eingesetzt, wobei die Auswertung des Vorwärtsstreulichts je nach abgelesenem Winkel Aussagen über das Volumen, und die des Seitwärtsstreulichts Aussagen über die innere Struktur und die Granularität der Zelle ermöglichen.
Fast immer werden zusätzlich Färbereagenzien oder spezifische Lysemittel eingesetzt, um die Differenzierung der weißen Blutzellen noch weiter zu unterstützen. Basophile Granulozyten bspw. kommen in sehr geringen Konzentrationen vor und sind ohne weitere „Behandlung“ bzw. Anfärbung nur schwierig von den eosinophilen oder neutophilen Granulozyten zu unterscheiden. Obgleich die optischen Methoden von den verschiedenen Herstellern eingesetzt wurden bzw. immer noch eingesetzt werden, ergeben sich oftmals Unterschiede in den erhaltenen Informationen. Einflussgrößen sind u. a. das jeweilige Färbereagenz, das Lysemittel und der genaue Winkel, an dem das Streulicht abgelesen wird.
Die ersten Diff-Systeme lieferten damit eine Differenzierung der fünf physiologisch vorkommenden Zellklassen und zeigen durch verschiedene Warnhinweise zusätzlich das Vorhandensein von anormalen Blutzellen an. Bis dato lieferte jedoch nur die Betrachtung des gefärbten Blutausstriches (mikroskopische Differenzierung) bei auffälligen Blutbildern mit anormalen oder unreifen weißen Blutzellen eine weiterführende Aussage.

Fluoreszenz-Durchflusszytometrie

Eine grundlegende Neuerung im Bereich der 5-part Differenzierung stellte die Einführung der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie im Jahr 1999 am Sysmex XE-2100 dar. Halbleiterlasertechnologie, spezifische Lyse und eine Anfärbung von Nukleinsäuren in Kern und Plasma mit einem Fluoreszenzfarbstoff inklusive der Auswertung der Fluoreszenzlichtempfänger in unterschiedlichen Winkeln ergaben sowohl für die Leukozytendifferenzierung, als auch für die Retikulozyten- und Thrombozytenanalytik eine Vielzahl neuer Informationen und ein hohes Maß an Genauigkeit – nicht nur bei unauffälligen Proben, sondern auch bei Vorhandensein von Interferenzen oder pathologischen Zellen.

Erweiterte Messtechnologien

In unserer neusten Gerätegeneration, der XN-Serie, werden neuartige Reagenzien verwendet. Diese ermöglichen u.a. die automatische NRBC-Messung bei jedem Blutbild und erstmalig auch ein dreidimensionales Flagging.
Eine absolute Neuheit der XN-Serie ist jedoch die einzigartige Modularität. Je nach Bedarf können die Systeme u. a. auch mit weiteren messtechnologischen Bausteinen (Applikationen) aufgerüstet werden und sich somit den Bedürfnissen Ihres Labors anpassen.
Sollten zukünftig viele Körperflüssigkeiten zu messen sein, muss kein neues System erworben werden, um die Messung durchzuführen. Selbst die kleinste XN-Konfiguration kann mit der Applikation „BF“ zur Messung von Körperflüssigkeiten nachgerüstet werden.
Die optionale Applikation „PLT-F“ kann das Basismodul ebenfalls erweitern und bringt zusätzliche Informationen für die Thrombozytenanalytik. Mit einem neuentwickelten Thrombozyten-Fluroreszenzmarker und dem im Vergleich zur Standardmessung 5-fach höheren Zählvolumen, können Thrombozyten in Extrembereichen so genau gezählt werden, dass die Ergebnisse mit der Referenzmethode (CD41/CD61) vergleichbar sind. Zudem wird der Anteil der „Immature Platelet Fraction“ ausgezählt. Die IPF dient zur Unterscheidung von Thrombopenien (KM-Versagen oder gesteigerter Verbrauch).

Literatur